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BD流式细胞仪细胞周期/DNA分析方法
点击次数:936 发布时间:2015-12-24
 一、鞘液准备(至少3LPBS,提前一天准备)
 
0.01M的PBS配制方法:800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO40.24g;调节pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH调节,各地蒸馏水的酸碱度不同),加蒸馏水定容至1L,0.22um滤膜过滤后,室温保存。
 
二、制备一个阴性对照来
 
    设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围:没有染色的细胞(制备过程如下1-6)
 
三、若做DNA倍体分析,需另设附加对照
 
    管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管,比例至少为2:1
 
四、BD流式细胞仪细胞周期/DNA分析实验步骤
 
1、将细胞消化后,用冷PBS洗细胞两次,300g×5min(若细胞数过少可提高转速到500g),为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心;
2、弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团,加入1mlBufferSolution并低速混匀细胞。
3、室温离心,300g×5min;
4、重复2、3一次;
5、弃上清留大约50ul下面的液体,加入1mlBufferSolution重悬细胞;
6、计数细胞,用BufferSolution将细胞密度调为1×106个/ml;
7、染色:
A.取0.5ml含细胞5×105个;
B.每管加入250ulSolutionA,用手轻拍混匀(勿用漩涡混匀);
C.室温反应10min,保留SolutionA;
D.加入200ulSolutionB,轻轻混匀;
E.室温反应10min,保留SolutionA+B;
F.加入200ul冷SolutionC,轻轻混匀,黑暗处2-8℃孵育10min;
用50um尼龙网过滤细胞,加入上样管上流式分析(3h内分析完)。
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