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热启动会影响荧光定量PCR仪反应测量吗?
点击次数:636 发布时间:2017-09-07
  热启动荧光定量PCR仪是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的佳延伸温度在72℃,聚合酶在室温仍然有活性。因此,在进行PCR反应配制过程中,以及在热循环刚开始,保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成,就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时,如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作,热启动PCR尤为有效。
  限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液,并将其置于预热的荧光定量PCR仪。这种方法简单便宜,但并不能完全抑制酶的活性,因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
  热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成,直到荧光定量PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐,尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分,如镁离子或酶,包裹起来,或者将反应成分,如模板和缓冲液,物理地隔离开。在热循环时,因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。类似手动热启动方法一样,蜡防护层法比较烦琐,易于污染,不适用于于高通量应用。
  Transitor®Hot Start Taq酶对于自动热启动PCR来说可靠。Transitor®Hot Start Taq是在常规Taq酶的基础上进行了化学修饰,使得该酶在低温或常温下没有酶活,因此在加样至PCR扩增前,不会产生由于引物随机粘连而形成的非特异性扩增。高温条件下,化学修饰集团会被剪切,从而释放酶活。此外,随着荧光定量PCR仪扩增的进行,酶活会被逐步释放,有效提高扩增效率及产物量。Transitor®Hot Start Taq DNA聚合酶在变性步骤的95℃保温过程中要持续20分钟才会被释放到反应中,从而完全恢复聚合酶活性。
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