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BD C6流式细胞仪标本的制备步骤及注意事项
点击次数:929 发布时间:2017-06-19
 一、 BD C6流式细胞仪标本的制备具体步骤:
 
1、收集细胞。上皮细胞需要蛋白酶消化,然后收集。加PBS或者流式洗液1ml,振荡,1400rpm离心5min,弃上清。
 
2、染表型悬浮细胞于100ul体积,细胞浓度约为或者小于1X10^6,加入流式染色抗体。按照说明书用量或者减半(根据经验),分出一管作为同型。
 
3、4℃,避光30min,用PBS洗一遍,1400rpm离心5min,弃上清。
 
4、破膜破膜剂以BDpharmingen破膜剂为例,加300ul,4℃,避光30min以现配的破膜洗液1ml洗一遍。1400rpm离心5min,弃上清。
 
5、胞内染色加入流式抗体4℃,避光30min。用破膜洗液1ml洗一遍,1400rpm离心5min,弃上清。
 
6、加入200ul1~2%多聚甲醛4℃避光保存。一般情况下,可直接把抗体加入到弃上清后的残留液里(体积大概为50ul左右)。
 
二、 BD C6流式细胞仪标本制备注意事项:
 
1、整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落;
 
2、洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性;
 
3、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色;
 
4、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
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